Sanger sekventering - fra mikroorganisme til DNA sekvens

Generelt om øvelsen.

Øvelsen Sanger sekventering - fra mikroorganisme til DNA sekvens er en øvelse, hvor bioinformatik er tænkt ind som en del af et tema om immunsystemet og infektionssygdomme til Biotek A elever. Elevforudsætningen er generel viden om DNA’s opbygning og proteinsyntese, og det er en fordel hvis eleverne har arbejdet i laboratoriet med PCR og gelelektroforese før. 

Øvelsen er delt op i 3 aktiviteter, som man kan undervise som et sammenhængende forløb. 

Aktivitet 1 er et virtuel lab, hvor eleverne guides igennem processen fra DNA oprensning fra bakteriekulture fra 6 patienter, PCR opformering af 16S SSU rRNA, oprensning af PCR produktet, PCR cycle sequencing og DNA sekventering ved gelelektrofrese. Det virtuelle lab er på engelsk og er et meget styret lab, dvs. at eleverne ikke rigtig kan lave fejl i det. Der står meget beskrivende tekst til hvad der sker, og det primære i denne øvelse er at eleverne sætter sig godt ind i stoffet for at kunne svare på de spørgsmål, der stilles i øvelsesvejledningen samt at de visuelt ser hvad der sker ved en Sanger sekventering.

Varigheden af aktivitet 1 er ca. 1 - 1 ½  time, afhængig af om eleverne svarer på spørgsmålene i timerne eller ej. 

Aktiviteten 2 viser, hvordan man tjekker kvaliteten af en Sanger sekventering ved at se på kromatogramtoppene fra laser detektoren, samt hvordan man laver en Contig (=konsensussekvens) ud af de ca. 700 basepar lange DNA sekvenser som man får ved Sanger sekventering. Til begge dele skal de bruge bioinformatik programmet Ugene. I øvelsen ser eleverne et eksempel på en Sanger DNA sekvens, for at få en forståelse af, at der er nogle baser man ikke kan bestemme med sikkerhed. De skal de visuelt se hvad der sker med kvaliteten af kromatogramtoppene i begyndelsen af en DNA sekvens, så de forstår hvorfor at metoden kun giver ca. 700 bp lange reads af sekvenserne.

Anden del af aktiviteten er at sætte 4 sekvenser sammen til en ca. 1500 bp lang sekvens, hvilket programmet gør ved at lave en alignment. Eleverne vil her visuelt kunne se hvordan det sker og få en forståelse af at DNA sekvens bestemmelse ikke altid er helt så ligetil som når man aflæser en serie af baser i en DNA database.

Varigheden af denne aktivitet er ca. 30 min.

Aktivitet 3. I denne aktivitet skal eleverne matche de 6 bestemte 16 S SSU rRNA sekvenser fra det virtuelle laboratorium med NCBI databasen vha BLAST search søgemaskinen. Da det er real life søgninger kan der forekomme ventetid, og det er derfor svært at vide præcist hvor lang tid søgningerne kommer til at tage, da det afhænger af aktiviteten af søgninger på databasen. Men typisk tager en søgning ca. 2 minuter, dvs i alt skal eleverne bruge ca. 12 minutter til søgningerne.